Die Prozessanalytik nutzt klassische chemische, physikalische und mathematische Techniken und Methoden als Werkzeuge für zeitnahe Erfassung kritischer Parameter in Produktions- und Umweltprozessen zu ermöglichen. Der Einsatz solcher Werkzeuge ist besonders attraktiv für die chemische und pharmazeutische Produktion, aber ebenso von Interesse für physikalische und biologische Vorgänge, Landwirtschaft, Lebensmittelproduktion und Medizin. Das Ziel ist in allen Fällen die zeitnahe Bereitstellung der für den Prozess relevanten Daten und Informationen, um präventiv eine optimale Produktqualität zu gewährleisten. Im Bereich der weißen Biotechnologie setzen sich zunehmend bioanalytische Methoden durch. Zur Überwachung der Produktion im Bereich Biomanufacturing, wie etwa der Herstellung von Impfstoffen und Medikamenten, sind in der Regel komplexe molekularbiologische Methoden notwendig, die Ergebnisse jedoch oft nur stark zeitverzögert liefern. Ein Ziel ist es, durch Automatisierung, Miniaturisierung und optimale Integration zeitnah Ergebnisse zu erhalten, die Rückschlüsse auf den Produktionsprozess und die Produktqualität zulassen. Bei der Herstellung von Impfstoffen im Fermenter oder Wave Bag steht die Überwachung der Synthese des gewünschten Produkts bis zur maximal möglichen Konzentration im Vordergrund. Gleichzeitig stellt der Fermentationsprozess mit seinen komplexen und vielfältigen Inhaltstoffen eine Herausforderung an den gezielten Nachweis des gewünschten Produkts dar. Der Nachweis geringster Produktmengen mit hoher Spezifität kann durch Einsatz der Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) erfolgen, die Informationen aus Viren oder Zellen verstärkt, um in den nachweisbaren Konzentrationsbereich zu gelangen. Dazu wird das Enzym DNA-Polymerase verwendet. Der Begriff „Kettenreaktion“ beschreibt die Tatsache, dass die Produkte vorheriger Zyklen als Ausgangsstoffe für den nächsten Zyklus dienen und somit eine exponentielle Vervielfältigung des Ausgangsmaterials erfolgt. PCR vervielfältigt einen kurzen, genau definierten Teil eines DNA-Strangs. Bei der Impfstoffproduktion wird zum Beispiel Virus-DNA aus dem Fermenter als Probenmaterial genutzt. Im Falle der prozessbegleitenden Analytik wird mit Hilfe der PCR die Zunahme an Impfstoff (etwa Viren) über die Produktionszeit verfolgt und die Produktion gezielt dann gestoppt, wenn die maximale Ausbeute erreicht ist. Die Entwicklungsarbeit richtet sich auf die Bereitstellung eines automatisierten Analysesystems für die DNA-Extraktion und -Amplifikation im kontinuierlichen Fluss. Diese Aufgabe soll mit der sterilen Entnahme der Probe aus dem zu überwachenden Fermentationsprozess und mit einer an den Amplifikationschip gekoppelten Detektionseinheit zur Bestimmung der produzierten Wirkstoffmenge kombiniert werden. Dafür werden zu definierten Zeiten homogene Proben aus dem Fermenter entnommen, die DNA isoliert und anschließend der PCR zugeführt, die kontinuierlich auf einem Bio-Chip arbeitet. Die DNA wird mit den für die PCR benötigten Chemikalien verdünnt und in Form einer Zweiphasenströmung mit einem Trennmedium in den PCR-Chip gefördert. Diese Probenverarbeitung ermöglicht ein kontinuierliches Monitoring mit einer Zeitverzögerung bis maximal eine Stunde.
Fermentationsüberwachung als Herausforderung
Zur Erzeugung der Zweiphasenströmung ist die äußerst genaue Dosierung des Trägermediums wie der DNA/PCR-Lösung notwendig. Zwei Mikrozahnringpumpen mzr-2521 aus der Niederdruckreihe von HNP lösen diese Dosieraufgabe. Die Volumenströme der Pumpen werden jeweils mittels eines Durchflusssensors kontrolliert und bei Abweichung vom Sollwert nachgeregelt. Mit einem definierten Volumenstrom von wenigen µl pro Minute wird die im Zweiphasenstrom fragmentierte Probe kontinuierlich über die verschiedenen Temperaturzonen des Chips gefördert und so die Virus-DNA vervielfältigt, bis sie durch eine Detektionseinheit quantifizierbar ist. Das Ergebnis dieser Analyse zeigt die Konzentrationszunahme des Medikaments/Impfstoffs im Fermenter. Die Prozesskette der integrierten Nukleinsäureanalytik ist abhängig von einem kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom mit den physikalischen Parametern Druck, Temperatur und Strömungsgeschwindigkeit. Zur Erzeugung der Zweiphasenströmung wurden verschiedene Systemkonfigurationen und Regelstrategien getestet. In einem ersten Ansatz wurden zwei Pumpenmodule bestehend aus Mikrozahnringpumpe, Filter und Rückschlagventil eingesetzt, um mittels getakteter Medienförderung eine Zweiphasenströmung zu erzeugen. Dazu wurde die Probe, eine wässrige Lösung, kontinuierlich, das Trägermedium, zum Beispiel Tetradekan oder Silikonöl, diskontinuierlich gefördert. Zur Aufrechterhaltung einheitlicher Abstände zwischen den Probenabschnitten wurde bei zunehmendem Füllgrad des Chips eine aufwändige Anpassung der Förderdrehzahlen erforderlich. Bei ungeregelter Erzeugung von Zweiphasenströmungen führen Änderungen der physikalischen Parameter zur Veränderung der Phasenlängen der zwei geförderten Medien und zu Veränderungen der Fließgeschwindigkeit, der nur mit einer komplexen Anpassung der Förderdrehzahlen entgegengewirkt werden kann. Damit erweist sich dieser Ansatz als ungeeignet für den praktischen Einsatz.Im zweiten Ansatz wurde ein volumenstromgeregeltes Fördersystem bestehend aus zwei Funktionsmodulen mit Mikrozahnringpumpe, Filter und Rückschlagventil entwickelt. Überwacht wurden die Pumpenmittels eines Volumenstromsensors. Dieses System ermöglicht die Erzeugung einer stabilen Zweiphasenströmung über Stunden bis Tage entsprechend den Anforderungen eines Fermentationsprozesses.
Stabile Zweiphasenströmung als Voraussetzung
Die Regelung des Volumenstroms bei der Erzeugung und Aufrechterhaltung der Zweiphasenströmung wirkt der Veränderung der Druckverhältnisse im Amplifikationschip bedingt durch unterschiedlichen Füllgrad, verschiedene Anteile der beiden Medien im Chip über die Zeit und Viskositätsänderungen durch unterschiedliche Temperaturzonen entgegen. Wie bei allen empfindlichen Prozessen sind der passende Versuchsaufbau und die Auswahl geeigneter Komponenten entscheidend für eine erfolgreiche Durchführung. Bei der beschriebenen Methode stellt sich die Auswahl der geeigneten Dosierpumpe als essenziell heraus. Die verwendeten Mikrozahnringpumpen zeichnen sich durch hohe Leistungsfähigkeit, hohe Präzision und geringe Pulsation aus. Die geringe Pulsation ist für die Erzeugung der Zweiphasenströmung besonders wichtig, da nur so ein kontinuierlicher Strom über längere Zeiträume aufrechterhalten werden kann. Die Integration von Mikrozahnringpumpen in Funktionsmodule bietet kompakte Lösungen, die mehr oder weniger komplex ausfallen können. Die einfachste Kombination ist die eines Filterelements und einer Mikrozahnringpumpe in einem Aufnahmeblock, der mit geringem Aufwand in komplexe Abläufe integriert werden kann. Die nächste Stufe ist die Integration eines 2/2-Wegeventil, mit dem die nahezu rückstoßfreie Absperrung der Fluidleitung erfolgt. Dieses Funktionsmodul bestehend aus Filter, Pumpe und Ventil eignet sich besonders gut für hochgenaue Pipettieraufgaben.
Prozesssicherheit bei kleinsten Volumenströmen
Für die Förderung kleinster Volumenströme ist ein weiteres Funktionsmodul mit Filter und Bypass vorgesehen. Der integrierte Volumenstromteiler teilt das Medium in einen Haupt- und Nebenstrom auf, wobei nur der deutlich kleinere Nebenstrom von wenigen µl pro Stunde zur Analyse verwendet wird. Zur Überwachung kleinster Volumenströmen lässt sich dieses Funktionsmodul mit einem Durchflusssensor ausstatten und so eine hohe Prozesssicherheit gewährleisten. Durch die Kombination von Probenahmegeräten mit direktem Kontakt zum Bioreaktor mit geeigneten Offline-Probenaufbereitungs- und Analyseinstrumenten kann man auch komplexe Analyseaufgaben lösen. Offline-Analytik reduziert sich nahezu auf die Analysezeit, wodurch gewonnene Parameter mit geringer Zeitverzögerung zur Prozesssteuerung herangezogen werden können. Das ermöglicht neue Methoden der Prozesssteuerung und Qualitätssicherung biotechnologischer Prozesse im Sinne der PAT-Initiative (Process Analytical Technology Initiative) der FDA. PAT-Systeme sehen die zeitnahe Analyse kritischer Qualitätsparameter vor, damit sowohl die Produktqualität verbessert als auch die Herstellungskosten gesenkt werden können. Die dargestellten Versuchsergebnisse wurden mit Mitteln des Bundesministeriums für Bildung und Forschung unter dem Förderkennzeichen 16SV3528 gefördert.☐
T +49/3871/451-318 F +49/3871/451-333 info@hnp-mikrosysteme.de www.hnp-mikrosysteme.de
• more@click-Code: PAK6927230
